Cas12a2はRNAを介して流産感染を誘発する

Nov 06, 2023

Nature volume 613、pages 588–594 (2023)この記事を引用

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細菌の流産感染システムは、侵入者が複製する前に感染細胞を停止または死滅させることにより、外来侵入者の拡散を制限します1,2。いくつかの RNA を標的とする CRISPR-Cas システム（つまり、タイプ III および VI）は、無差別にヌクレアーゼを活性化することによって流産感染表現型を引き起こします3、4、5。ただし、RNA 誘導性シングルエフェクターヌクレアーゼの無差別 DNase 活性を利用する、CRISPR 媒介の流産メカニズムはまだ観察されていません。今回我々は、V型シングルエフェクターヌクレアーゼCas12a2によるRNAターゲティングが、二本鎖DNA（dsDNA）の非特異的切断を通じて不育症感染を引き起こすことを報告する。 Cas12a2 は、活性化プロトスペーサー隣接配列で RNA 標的を認識した後、一本鎖 RNA (ssRNA)、一本鎖 DNA (ssDNA)、および dsDNA を効率的に分解します。細胞内では、Cas12a2 の活性化により SOS DNA 損傷反応が誘発され、増殖が阻害され、侵入者の蔓延が防止されます。最後に、我々は Cas12a2 の付随的活性を RNA の直接検出に利用し、Cas12a2 が RNA 誘導型 RNA ターゲティングツールとして再利用できることを実証しました。これらの発見は、CRISPR-Cas システムの既知の防御能力を拡張し、CRISPR テクノロジーのさらなる機会を生み出します。

生命のあらゆる領域では、感染性物質の蔓延を制限するために、細胞を休眠状態にするか死滅させる防御戦略が使用されています1。細菌や古細菌では、この戦略は不育症感染と呼ばれ、多種多様な細菌防御システムによって使用されています 1,2。最近、RNA を標的とする CRISPR RNA (crRNA) 誘導性の適応免疫システムが流産感染表現型を引き起こすことが示されました 3、4、5、6。 VI 型システムは RNA を非特異的に分解し、それにより Cas13 単一エフェクターヌクレアーゼは crRNA 誘導型エフェクターと無差別 RNase の両方として機能します3、7、8。 III 型システムでは、標的 RNA の結合により環状オリゴアデニレート二次メッセンジャーの生成が引き起こされ、次に無差別のアクセサリー RNase および ssDNase が活性化され、不育症感染を引き起こす可能性があります 4、5、9、10、11。さらに、不育症感染は、III 型セカンダリメッセンジャーを介して活性化される無差別 dsDNase (NucC など) 12,13 または V 型 Cas12a シングルエフェクターヌクレアーゼからの無差別 ssDNase 活性によって媒介されることが提案されています。ただし、III 型 CRISPR 媒介 dsDNase 活性はまだ in vivo で検査されておらず、Cas12a の ssDNase 活性は流産感染を引き起こさないことが最近示されました 15。

今回我々は、V型シングルエフェクターCRISPR関連（Cas）ヌクレアーゼであるCas12a2が、crRNAガイドに相補的なプラスミドで攻撃された場合、流産感染表現型を誘導することを報告する。組換えタンパク質を用いた生化学的アッセイにより、Cas12a2 が RNA 標的を認識し、他の単一サブユニット RNA 標的化 (Cas13a など) や dsDNA 標的化 (Cas12a など) とは異なる非特異的な dsDNA、ssDNA、および ssRNA ヌクレアーゼ活性を発揮することが明らかになりました。 ) Cas ヌクレアーゼ 8、16、17。さらに、Cas12a2 の非特異的ヌクレアーゼ活性が細菌 DNA に損傷を与え、SOS 応答を引き起こし、細胞増殖を阻害することを示します。これらの結果を総合すると、Cas12a2 の dsDNase 活性が流産感染表現型の誘発に役立っていることが示唆されます。原理証明の実証として、我々は、Cas12a2 がさまざまな温度において RNA を標的とする Cas13a ヌクレアーゼと同等の感度で RNA を検出できることを示します。

Cas12a2 は、Cas12a16 に関連する V 型エフェクターヌクレアーゼのグループで構成されており、Cas12a2 オルソログは以前は Cas12a バリアントとして分類されていました 18。我々の分析でも同様に、Cas12a ヌクレアーゼと最後の共通祖先を共有する単系統クレードにそれらが配置されています（図 1a および拡張データ図 1）。さらなる分析により、CRISPR – Cas12a2およびCRISPR – Cas12aシステムは、保存された3 '末端を持つCRISPRリピートを特徴とし、ヌクレアーゼは相同なRuvCエンドヌクレアーゼドメインとN末端に同様の予測された二次構造を有することが明らかになりました（図1bおよび補足図2）。。 RuvC 様ドメインと N 末端が保存されているにもかかわらず、Cas12a2 は、Cas12a のブリッジヘリックスの代わりに機能不明の大きなドメインが存在すること、および Cas12a Nuc ドメインの代わりにジンクフィンガードメインが存在することにより Cas12a と区別されます (図1bおよび補足図2)。我々の系統解析および最近の構造結果と組み合わせたそれらの元の分類を考慮し、これらの異なる V 型ヌクレアーゼを Cas12a2 と名付けました。

a、Cas12a および Cas12b ヌクレアーゼによる同定された Cas12a2 ヌクレアーゼの最尤系統発生。詳細な系統発生は拡張データ図 1 に示されています。Cas12a2 と Cas12a が共起する系は、黒丸の赤丸と青丸で示されています。 SuCas12a2 は塗りつぶされていない赤丸で示されます。 b、LbCas12aと比較したSuCas12a2のドメインアーキテクチャ。ああ、アミノ酸。 c、代表的な Cas12a2 および Cas12a ヌクレアーゼに関連する整列したダイレクトリピート。太字のヌクレオチドは、両方のヌクレアーゼの処理された反復内の保存された位置を示します。 Cas12a リピートの予測されるシュードノット構造を以下に示します。ヘアピン(グレー)のループは可変です。 SuCas12a2 による pre-crRNA プロセシングを拡張データ図 3.d、Cas12a2 をコードする代表的なゲノム遺伝子座内の CRISPR-Cas システムの遺伝子構成に示します。唯一の Cas ヌクレアーゼとして Cas12a2 をコードするシステム、および Cas12a もコードするシステムの例が示されています。 e、従来型（上；標的ヌクレアーゼ選択（tns））および改良型（下；ヌクレアーゼ選択（ns））プラスミド干渉アッセイの図。 Cm、クロラムフェニコール。カン、カナマイシン。 f、標的プラスミドおよびヌクレアーゼプラスミド選択下でのSuCas12a2およびLbCa12a2のプラスミド形質転換の減少。 g、標的プラスミドおよびヌクレアーゼプラスミド選択下でのSuCas12a2 RuvC変異体のプラスミド形質転換の減少。 f および g については、データは、別々のコロニーから開始された少なくとも 3 回の独立した実験の平均値 ± SD です。 P 値は、片側ウェルチ t 検定を使用して計算されました。 NS、P > 0.05; *P < 0.05、**P < 0.005。

特に、一部の CRISPR-Cas システムには、共有 CRISPR アレイの隣に cas12a2 遺伝子と cas12a 遺伝子の両方が縦列に含まれています（図 1c）。この観察と、いずれかのヌクレアーゼを含むシステムからのCRISPRリピートの保存（図1dおよび補足図3）から、両方のタンパク質が同様のcrRNAガイドに結合して処理するという仮説を立てました。しかし、タンパク質は他のドメインで分岐しているため、我々はさらに、Cas12a2 が Cas12a16 の dsDNA を標的とする活性とは異なる防御機能を実行しているという仮説を立てました。

これらの仮説を検証するために、我々は硫黄酸化イプシロンプロテオバクテリア Sulfuricurvum sp. の cas12a2 遺伝子をコードしました。 PC08-66 (SuCas12a2) を CRISPR アレイとともに発現プラスミドに組み込み、これを大腸菌細胞に導入しました。次に、ヌクレアーゼとcrRNAを含むプラスミドおよび標的プラスミドを選択することにより細胞を枯渇させる従来のプラスミド干渉アッセイを実行しました（図1e）。このアッセイは広範な免疫系活動を検出しますが、標的を枯渇させるだけの防御活動と不育症感染表現型を活性化する防御活動を区別することはできません。 Cas12a2が不育症感染メカニズムを使用しているかどうかをテストするために、ヌクレアーゼプラスミドのみを選択することによってアッセイを変更しました（図1e）。 Cas12a2はCas12aと比べて異なる機能を有するという我々の仮説と一致し、従来のプラスミド干渉アッセイ（約1,900倍の減少）と改良型（約1,300倍の減少）の両方のプラスミド干渉アッセイにおいてCas12a2は細胞を枯渇させたが、ラクノスピラ科細菌由来のCas12a（LbCas12a）は細胞のみを枯渇させた。従来のアッセイでは (図 1f)。同じプラスミド位置にクローニングされた異なるターゲット、異なる Cas12a2 ホモログ、および SuCas12a2 と Prevotella bryantii B14 由来の Cas12a ホモログ (Pb2Cas12a) を比較した場合にも、同様の傾向が観察されました (拡張データ図 2a、b)。さらに、SuCas12a2の3つのRuvCモチーフのいずれか内の予測活性残基を変異させると、免疫機能が損なわれました（図1g）。まとめると、これらの結果は、Cas12a2 が RuvC ヌクレアーゼドメインに依存し、Cas12a とは異なる機構を通じて不育症感染を誘導することを示しています。

流産感染表現型（III 型や VI 型など）を引き起こす CRISPR システムは、RNA ターゲティングによって活性化される無差別ヌクレアーゼに依存しています 3,4,5。 Cas12a2が同様のメカニズムを使用するかどうかを判断するために、SuCas12a2を組換え的に発現および精製し、その酵素活性をインビトロでテストしました（図2および補足図4）。ただし、核酸ターゲティング活性を調べる前に、Cas12a2 crRNA がどのようにプロセシングされるかを決定する必要がありました。

a, 精製された SuCas12a2 – crRNA 複合体による、さまざまな FAM 標識核酸基質の直接ターゲティング。 b、1時間後の、SuCas12a2-crRNA複合体と、異なる標的RNA基質によるFAM標識非標的核酸基質の側副切断。ターゲット RNA、3' 末端の非自己隣接配列。セルフフランク、crRNAリピートタグの逆相補体に変異したフランキング配列。側面はなく、crRNA ガイドの逆相補体のみです。 a と b について、標的核酸と非標的核酸の図を右側に示します。 c、標識された非標的RNA、ssDNA、またはdsDNAのRNA誘発性側副切断の経時的分析。代表的なゲル画像を拡張データの図 4c に示します。 dsDNA には RNA および ssDNA の 2 倍の ssDNA 基質が含まれていますが、標識鎖の濃度は同じであることに注意してください。 d、3つのRuvCモチーフのそれぞれを変異させた場合の、RNA誘発性のdsDNAの側副切断に対する影響。 e、非標的プラスミド DNA の RNA 誘発側副切断の経時的分析。プラスミド DNA は臭化エチジウムを使用して視覚化されました。 a ～ d について、星印は FAM 標識基質を示し、右側の図は基質を示します。すべての結果は 3 つの独立した実験の代表です。ゲルソースデータは補足図1に提供されています。

Cas12a および Cas12a2 システムの CRISPR リピートは 3' 末端で高度に保存されており（図 1d および補足図 3）、配列アラインメントから、Cas12a2 は Cas12a pre-crRNA プロセシング活性部位の領域で二次構造を共有していることが予測されます。、20（補足図5）。この予測と一致して、in vitroでSuCas12a2によってプロセシングされたpre-crRNAのRNA配列分析により、プロセシングがCas12aによって切断された位置の1ヌクレオチド下流で起こることが明らかになりました（拡張データ図3a、b）。スペーサーの 3' 末端も in vivo でトリミングを受け、おそらく Cas9 crRNA で観察されたように宿主リボヌクレアーゼを介して、約 24 ヌクレオチドのガイドを形成しました (拡張データ図 3b、c)。予測されるRNAプロセシング活性部位に位置する塩基性アミノ酸（Lys784およびArg785）を変異させると、活性が消失した22（拡張データ図3d）。さらに、プラスミド干渉アッセイにより、Cas12a と Cas12a2 は免疫を損なうことなくガイドを交換できることが明らかになりました (拡張データ図 2c)。したがって、Cas12a2 ヌクレアーゼは、他の V 型エフェクターヌクレアーゼと同様に独自の crRNA ガイドを処理し 20,23 、Cas12a と crRNA を共有することができます。

crRNA誘導性Cas12a2の核酸標的優先性を決定するために、A/Tリッチな隣接配列（Cas12a基質と平行）を含む相補的ssRNA、ssDNAおよびdsDNA基質16,22をFAM分子で蛍光標識し、crRNAと結合させた。誘導されたCas12a2（図2a）。不育症感染を引き起こす CRISPR-Cas システムと同様に、dsDNA を標的とする Cas12a とは対照的に、Cas12a2 は相補的 RNA 標的の存在下でのみ活性化されます。この構築物には標的の上流に定義されたプロモーターがないことを考えると、SuCas12a2 に対するプラスミド干渉の効力（図 1f）は注目に値しました。しかし、我々は2つの理由から、この干渉はコードするプラスミドの誤った転写によるものであると考えています。1つは上流ターミネーターの導入により大腸菌におけるプラスミド干渉が大幅に減少したこと（拡張データ図2d、e）、もう1つは大腸菌における付随的活性を検出するために上流プロモーターが必要であったということです。無細胞転写翻訳アッセイ24（拡張データ図2f、g）。

他の Cas 不育症感染メカニズムは付随的な無差別 RNase 活性に依存しているため、Cas12a2 による特定の RNA ターゲティングが無差別ヌクレアーゼ活性を誘導するかどうかを調べました。われわれは、SuCas12a2 が、crRNA ガイドと相補性を持たない FAM 標識 ssRNA、ssDNA、および dsDNA 基質を強力かつ無差別に分解することを発見しました。対照的に、他の Cas ヌクレアーゼは、RNA ターゲティング後に ssRNA (Cas13a)8 または ssRNA と ssDNA (Cas12g)25 のみ、または dsDNA ターゲティング (Cas12a)14 後に ssDNA のみを無差別に分解します (図 2b および拡張データ図 4a)。 3 つの側副基質のうち、ssRNA と ssDNA は、Cas12a2 によって dsDNA より効率的に切断されるようです (図 2c および拡張データ図 4b)。しかし、この違いは、同じ量のヌクレアーゼに対して、ssDNA 基質と比較して dsDNA 基質には 2 倍の DNA 鎖が存在することによって説明できます。また、Cas13a8 と同様に、相補的 ssDNA および dsDNA は Cas12a2 非特異的ヌクレアーゼ活性を活性化せず (拡張データ図 4a)、dsRNA は側副切断の主要な基質ではありません (拡張データ図 4c)。

Cas12a2 活性が標的に隣接する「非自己」シグナル (プロトスペーサー隣接配列 (PFS) と呼ばれる) の検出に依存しているかどうかを調べるために、標的 RNA 配列を 3' 末端に隣接させる in vitro 切断アッセイを実施しました。 crRNA リピート (5'-AUCUA-3')、in vivo アッセイで使用される非自己 PFS (5'-GAAAAG-3')、またはそれに相補的な「フランクレス」RNA に相補的な「自己」配列を持つ側crRNAのガイド領域ですが、PFSは含まれていません（図2b）。特に、非自己 PFS を含む RNA 標的のみが側副ヌクレアーゼ活性を活性化し、Cas12a2 の側副活性を活性化するには RNA 標的の 3' 末端に特定のヌクレオチドが存在する必要があることが示されました。さらに、3つのRuvCモチーフのいずれか、または推定上のジンクフィンガードメイン内の保存されたシステイン残基に破壊的変異を導入すると、すべての非特異的切断が廃止され（図2dおよび拡張データ図4d）、これは我々のin vivoプラスミド干渉結果と一致しています（図1g）。

私たちの生化学的アッセイは、Cas12a2 が線状 dsDNA 基質から FAM 標識を迅速に除去できることを実証しましたが、Cas12a2 が利用可能な 5' 末端または 3' 末端を欠く DNA を分解するかどうかは不明でした。したがって、我々は、RNA標的およびスーパーコイルpUC19プラスミドを用いてcrRNA誘導性Cas12a2に挑戦した。重要なのは、pUC19 には Cas12a2 crRNA ガイドに相補的な配列が含まれていないことです。我々は、SuCas12a2がpUC19 DNAに急速にニックを入れ、線状化し、分解することを観察しました（図2e）が、同族の標的とPFSが存在し、無傷のRuvCドメインがある場合にのみ発生します（拡張データ図4e）。スーパーコイルプラスミドのこの急速な破壊は、Cas12a ヌクレアーゼによるプラスミド DNA のゆっくりとした不完全な直線化とは対照的です 26。これらのデータは、活性化された SuCas12a2 が、スーパーコイル、ニック、または直鎖のいずれであっても、非特異的 DNA のホスホジエステル主鎖を強力に加水分解できるメカニズムを示唆しています。 Cas12a (副次的 ssDNase による dsDNA ターゲティング)、Cas13a (副次的 ssRNase による ssRNA ターゲティング)、および Cas13g (副次的 ssRNase および ssDNase による ssRNA ターゲティング) との比較により、RNA ターゲティング ssRNase、ssDNase、および dsDNase が SuCas12a2 に固有であることが実証されました (拡張データ図.4a)。まとめると、これらの in vitro 結果は、crRNA が SuCas12a2 を RNA 標的に導き、ssRNA、ssDNA、および dsDNA の RuvC 依存性切断を活性化することを明らかにしています。これらの活動の一部または全体が、流産感染表現型の根底にある可能性があります。

私たちの in vitro データは、Cas12a2 不育症感染表現型の根底にあるメカニズムを示していましたが、私たちはこれらの異なる酵素の標的制限を理解したいと考えていました。特に、非自己 PFS 配列認識の厳密性と、crRNA とターゲット間の不一致に対するペナルティを調査しました。したがって、RNA標的の3'末端から-5位までの可能なすべての1,024の隣接配列をコードするプラスミドのライブラリーを用いてSuCas12a2に挑戦しました（図3aおよび拡張データ図5a、b）。われわれは、SuCas12a2 がライブラリー内の全配列の約半分を枯渇させていることを発見した。これは、Cas13 よりも厳格であるが、ほとんどの DNA ターゲティングシステムよりもさらに無差別な PFS 認識機構を示唆している 8,27。枯渇した配列は一般にAが豊富で、5'-GAAAG-3' PFSと一致していましたが、単一のコンセンサスモチーフによって完全に捕捉できませんでした（図3aおよび拡張データ図5c）。さらに、柔軟な PAM 認識で知られるヌクレアーゼである Pb2Cas12a では認識されないが、SuCas12a2 によって認識される 5 つのユニークなモチーフ内の代表を含む、個々の枯渇配列を検証しました 24 (図 3b および拡張データ図 5d)。 RNA ターゲティングヌクレアーゼとしての機能と一致して、認識された配列は広範でしたが、Cas12a2 が主にタグとアンチタグの相補性を評価している場合、予想されるプロファイルには従いませんでした。これらの結果は、SuCas12a2 による PFS 認識が、活性化するために PFS または RNA PAM の認識を必要とする III 型システムと同様に機能し 28,29,30,31 、RNA によって使用されるタグとアンチタグの相補性の評価とは異なるメカニズムをさらに裏付けています。 - Cas 138,32 およびその他のタイプ III CRISPR-Cas システムを標的とする 33。

a、大腸菌においてSuCas12a2によって認識される実験的に決定されたPFSおよびモチーフ。 PFSの位置-4から-1を捕捉するモチーフが示されており、3'から5'と書かれている。 B は C、G または U を表します。 K は G または U を表します。ＲはＧまたはＡを表す。 W は A または U を表します。 Y は C または U を表します。結果は 2 つの独立した画面を表しています (拡張データ図 5)。ｂ、スクリーニングで同定され、Ｐｂ２Ｃａｓ１２ａではなくＳｕＣａｓ１２ａ２によるターゲティングを許容する、選択されたＰＦＳの検証。 c、大腸菌におけるSuCas12a2によるプラスミド標的化に対するガイドミスマッチの影響。 d、既知のAcrVAタンパク質によるSuCas12a2に対する阻害の程度。 Acr タンパク質は、大腸菌または無細胞転写翻訳反応において、さまざまな Cas12a ホモログに対して阻害活性を示すことが確認されました (拡張データ図 5)。データは、別々のコロニーから開始した少なくとも 3 回の独立した実験の平均値 ± SD です。統計分析は、片側ウェルチ t 検定を使用して実行されました。

ほとんどの DNA および RNA を標的とする Cas ヌクレアーゼは、シード領域内のミスマッチに対して高い感受性を示しており、crRNA ガイドとターゲット間の単一のミスマッチにより結合が破壊されます 8、17、34、35。したがって、SuCas12a2がシード領域に依存しているかどうかを特定するために、細胞ベースのアッセイでSuCas12a2がどのようにミスマッチを許容するかを評価しました（図3c）。特に、SuCas12a2 は標的全体にわたる単一および二重のミスマッチに対応しており、PFS 遠位の変異はプラスミドのターゲティングにさらに悪影響を及ぼします。 SuCas12a2ターゲティングを完全に破壊するには、ガイド全体で4つのミスマッチ（図3c）、または24ヌクレオチドガイドの3'末端で最大10のミスマッチが必要でした（拡張データ図6a）。柔軟な PFS 認識とガイドとターゲットの不一致に対する耐性は、SuCas12a2 が無差別なターゲット認識を示し、ガイドとターゲットの不一致に過敏な標準シードを欠いているように見えることを示しています 34,35。しかし、ガイドの 3' 末端との必要な対形成は、この末端が crRNA-Cas12a2 二元複合体の構造内であらかじめ順序付けられており 19、標的との塩基対形成を開始している可能性があることと一致しています。さらに、この乱交により、SuCas12a2は、Cas12aによるターゲティングを妨害する標的変異を認識できるようになった（拡張データ図6b）。

まとめると、Cas12aと比較したCas12a2の異なる活性は、両方のヌクレアーゼを有するタンデムシステム（図1d）が協力して作用して外来ウイルスおよびプラスミドに対する有効性を拡大する可能性があることを示唆しました。特に、我々は、Cas12a2 の独特な構造的特徴が、Cas12a 機能をブロックする抗 CRISPR タンパク質をコードするウイルスの逃走を防ぐ可能性があると仮説を立てました 36,37,38。この仮説と一致して、7つのCas12a抗CRISPRタンパク質のうち1つ（AcrVA2.1）だけが、部分的ではあるがCas12a2の機能を損なうことができました（図3dおよび補足図6a、b）。注目すべきことに、SuCas12a2がこのAcrによって化学修飾されてPAM認識をブロックするCas12aに保存されたリジン残基を持っているにもかかわらず、AcrVA5も阻害活性を示さなかった39（図3dおよび補足図6c）。 Cas12a Acr タンパク質が SuCas12a2 を阻害する能力が限られているということは、これらのヌクレアーゼの異なる特性と、免疫防御において Cas12a と Cas12a2 が相互に補完し合う能力をさらに強調しています。

我々の最初の結果は、Cas12a2 が流産感染表現型を引き起こすことを示していますが、1 つのシナリオは、誘発された Cas12a2 がすべてのプラスミドを選択的に除去し、導入された抗生物質の選択に細胞が屈することを可能にするというものでした。この可能性を評価するために、標的crRNAを使用してSuCas12a2およびLbCas12aを誘導した後、さまざまな抗生物質選択条件（抗生物質なし条件を含む）下で液体培養における大腸菌の増殖を評価しました（図4aおよび補足図7）。 SuCas12a2は、プラスミド選択の非存在下で培養増殖を抑制したが、LbCas12aは抑制しなかった。これは、Cas12a2による流産感染表現型の誘導をさらに裏付けるものであった。

a、異なる標的条件および抗生物質投与下でのSuCas12a2、LbCas2a2またはLsCas13aプラスミドの存在下での大腸菌の増殖停止。 A600、600 nm での吸光度。 b. ヨウ化プロピジウム（PI）で染色された大腸菌細胞のパーセンテージは、抗生物質選択なしでのターゲティング前（非誘導）およびターゲティングの4時間後（誘導）の生存率損失を示します。ゲート戦略は補足図 7.c に示されています。抗生物質選択なしで誘導後 2 時間の SuCas12a2、LbCas12a、または LsCas13a2 による大腸菌における RNA 分解のさまざまな程度。結果は、重複した独立した実験を表しています。独立した 4 つの重複については、拡張データの図 7 を参照してください。低分子 RNA プールには、tRNA およびその他の低分子 RNA が含まれます。 d、抗生物質選択なしでSuCas12a2、LbCas12aまたはLsCas13aによるプラスミド標的化の4時間後の大腸菌におけるGFPのSOS応答性発現。時間経過データを補足図9に示します。RFU、相対蛍光単位。 e、抗生物質選択なしでSuCas12a2、LbCas12aまたはLsCas13aによる標的化の4時間後の大腸菌における相対DNA含有量。 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) の蛍光と細胞サイズをフローサイトメトリーを使用して測定しました。各円、または垂直に並んだ円のペアは、同じ生物学的複製からの主要な部分集団を表します。対応する等高線図を拡張データ図 8 に示します。FSC、前方散乱。 f、RNA検出アッセイ。室温 (RT) で ssRNA ビーコンとともにインキュベートした Cas12a2 による RNA 検出の限界。データは、3 回の独立した実験の平均値 ± 標準誤差です。 g. 核酸ターゲットおよびレポーター、ならびに Cas12a2 およびその他の Cas 検出器の非増幅検出限界 (LOD) 46。 Aap、アリサイクロバチルス・アシディフィルス; Lwa、レプトトリキア・ワデイ。 Lbu、レプトトリキア・ブカリス。 h. SuCas12a2 による無差別 RNA ターゲティングと側副分解、および細胞に対するその効果について提案されたモデル。 b および d のデータは、別々のコロニーから開始した 4 回の独立した実験の平均値 ± SD です。統計分析は、片側ウェルチ t 検定を使用して実行されました。 NT、非ターゲットプラスミド。 T、ターゲットプラスミド。

未解決の疑問の 1 つは、流産感染表現型が細胞の休眠または細胞死によって引き起こされたかどうかです。最近、Cas13a が RNA 標的を認識した後、広範な RNA 分解を媒介して細胞の休眠を促進し、ファージ感染を抑制することが示されました 3。したがって、我々は、Leptotricia shahii の代表的な Cas13a (LsCas13a) を液体培養アッセイに導入しました。 SuCas12a2と同様に、LsCas13aはプラスミド選択がない場合でも増殖を抑制しました（図4aおよび補足図7）。

LsCas13aとの我々の比較は、SuCas12a2による増殖抑制が非特異的RNA切断を通じて起こり、細胞の休眠を引き起こす可能性があることを示唆したが、我々のin vitroデータは、非特異的dsDNA切断も細胞死を引き起こすことによって増殖を抑制する可能性があることを示した。 SuCas12a2 を含む細胞が細胞死を起こしているかどうかを評価するために、Cas12a2 と Cas13a の両方に対してヨウ化プロピジウムを使用して細胞生存率アッセイを実行しました。 4時間後には、Cas12a2とCas13aの両方について、わずかな割合（約10％）の細胞死のみが観察されました（図4bおよび補足図8）。したがって、Cas12a2 の無差別なヌクレアーゼ活性はある程度の細胞死を引き起こしますが、Cas12a2 活性の主な結果は細胞休眠表現型として説明する方が適切です。

Cas12a2 は休眠を引き起こすようですが、いくつかの無差別ヌクレアーゼ活性のどれが関与しているかは不明でした。 SuCas12a2 が RNA 切断を通じて休眠を引き起こすかどうかを判断するために、細胞の全 RNA をターゲティング条件および非ターゲティング条件下で検査しました。 Cas13aはrRNAと低分子RNAプール（tRNAを含む）の両方を有意に枯渇させましたが、Cas12a2は低分子RNAプールのみを有意に枯渇させました（図4cおよび拡張データ図7）。

ターゲティング条件下で観察された RNA 分解の違いを考慮して、SuCas12a2 の無差別 dsDNase 活性が流産感染表現型との関連で検出可能かどうかを調べました。私たちは、SuCas12a2 によって引き起こされる広範な dsDNA 損傷が SOS 応答を引き起こし、成長を阻害すると推論しました 40,41。この主張と一致して、SuCas12a2を使用したプラスミドターゲティングは、非ターゲットコントロールと比較してSOS応答性レポーターコンストラクトからのGFP発現を有意に誘導しました42が、LbCas12aおよびLsCas13aはGFP発現をほとんど誘導しませんでした（図4dおよび補足図9）。さらに、SuCas12a2を標的とした培養物は、抗生物質選択の非存在下で2つの亜集団に分岐しました。1つはDNA含有量が少ないコンパクト細胞で表され、もう1つはDNA含有量が高い糸状細胞で表されます（図4eおよび拡張データ図8および9）。 LbCas12a および LsCas13a を発現する培養物では、標的プラスミドと非標的プラスミドの細胞サイズおよび DNA 含有量に顕著な差は見られませんでした。細菌染色体を特異的に標的とした他の CRISPR-Cas システムを用いた以前の研究では、同様の形態学的変化が観察されており 43,44,45 、これらの異なる形態が dsDNA 損傷によるものであることが示唆されています。これらの結果は、SuCas12a2 による RNA ターゲティングが細菌染色体の dsDNA 損傷を引き起こし、それが細菌の SOS 応答と不育症感染を誘導することを示しており、無差別な dsDNase 活性に依存する独特の免疫機構を反映しています。この観察と一致して、最近のクライオ電子顕微鏡構造により、Cas12a2 が他のすべての CRISPR 関連ヌクレアーゼとは完全に異なる機構を通じて dsDNA に結合し、切断することが明らかになりました。また、インビトロ側副 dsDNase は損傷しているが、ssRNase と ssDNase は損傷していない構造誘導変異体とは異なります。この活性は、プラスミドに対する生体内防御活性を無効にする19。

CRISPR シングルエフェクターヌクレアーゼは、遺伝子編集から分子診断まで多くの用途に再利用されています。 Cas12a2 をバイオテクノロジーツールとして再利用できるかどうかを判断するために、RNA の検出に SuCas12a2 を採用しました。 RNA標的に相補的なcrRNAガイドでapo SuCas12a2をプログラムし、蛍光団と消光剤の分離により切断後に蛍光を発するssDNAまたはssRNAビーコンと複合体をインキュベートしました（図4f）。このアプローチを使用すると、ssDNA プローブと ssRNA プローブの両方を使用して 37 °C および室温で RNA を検出でき、検出限界は他の単一サブユニット Cas ヌクレアーゼで観察された範囲内でした 46 (図 4f および拡張データ図 10a)。 –c)。さらに、我々はプラスミド DNA と DNA ニックトランスレーション 47 を使用する改良型検出アッセイを考案し、CRISPR ベースの診断に明確な陽性読み取り値を導入しました (拡張データ図 10d–f)。これらのデータは、Cas12a2 が科学、バイオテクノロジー、農業、医学におけるアプリケーションのツールとして容易に再利用できることを示しています。私たちは、この酵素のユニークな活性をさらに活用して、CRISPR ベースのツールキットを拡張できると期待しています。

まとめると、我々のデータは、Cas12a2ヌクレアーゼが細胞質dsDNAおよび低分子RNAのRNA誘発性分解を示し、宿主細胞の増殖を妨げ、流産感染表現型を誘発するというモデルを裏付けています（図4h）。このメカニズムは、他の CRISPR-Cas システムによって示される、標的を絞った侵入者排除または不育症感染活動とは対照的です。具体的には、Cas12a2 によって示される機構は、宿主細胞 DNA を分解して細胞を死滅させる無差別二本鎖 DNase NucC に依存する、最近報告された CBASS 防御システムを彷彿とさせます 12。特に、一部の III 型システムは NucC 酵素をコードしており、他の CRISPR-Cas システムが同様の DNA 分解不育症感染メカニズムを使用するように収束的に進化したことを示唆しています 13,48。

SuCas12a2 は、ゲノムに損傷を与えて SOS 応答を誘導することに加えて、柔軟な PFS およびミスマッチ耐性を通じて無差別 RNA 認識を示します。この標的認識の柔軟性は、III 型および VI 型システムで観察されるタグとアンチタグの相補性の柔軟性を反映しており 8,33、急速に進化するファージに対して特に有利である可能性がありますが、そのような乱雑さがファージの共通の特徴であるかどうかを判断するには Cas12a2 オーソログを特徴付ける必要があります。これらのヌクレアーゼ。 PFS は柔軟ではありますが、リピートの対応する PFS 含有部分が認識された PFS (DNA 内の PAM の自己/非自己認識の標準的な特徴) から大きく乖離しているため、CRISPR アレイの偽のアンチセンス転写の自己認識を防ぎます。 -CRISPR–Cas システムを標的とする49。 PFSと標的認識の柔軟性は、単一のCRISPRアレイに隣接するCas12aとCas12a2の両方をコードする生物においてCas12aによるDNA標的の正確な認識とクリアランスが失敗した場合のバックアップメカニズムとしてさらに機能する可能性があります（図1a、dおよび拡張データ）図1および6b)。この二重ヌクレアーゼ戦略は、同じ侵入者を標的とする複数の CRISPR-Cas システムをコードする細菌に似ていると考えられます 50。ただし、これら 2 つのヌクレアーゼが感染症に対抗するためにどのように連携するかを理解するには、さらなる研究が必要です。

ヌクレアーゼ媒介の crRNA 生合成、RNA ターゲティング、および ssRNA、ssDNA、特に dsDNA の側副切断の組み合わせにより、Cas12a2 は他の既知の Cas ヌクレアーゼとは区別されます。無差別な RuvC ヌクレアーゼ活性を活性化するには、SuCas12a2 による A-rich フランキング配列を認識する必要があることは明らかであり、Cas12a2 がリピートタグとターゲット間の相補性にのみ依存するのではなく、RNA ターゲットに隣接する正しい PFS に結合して切断を活性化する必要があることを強く示しています。自己配列と非自己配列を区別するためのアンチタグペア。他のいくつかの RNA 標的 Cas ヌクレアーゼおよび複合体に典型的です 8,33,51,52。 Cas12a2による標的認識と側副切断の活性化の根底にある分子基盤を研究することで、CRISPRヌクレアーゼが自己標的と非自己標的を区別するために使用する新たな機構が明らかになる可能性がある。 RNA ターゲティングおよび側副 dsDNA 捕捉の段階における Cas12a2 の最近の低温電子顕微鏡構造は、すでにこのニーズを満たしています 19。

Cas12a2 は、CRISPR テクノロジーにとって大きな可能性を秘めています。原理実証の実証として、我々は、SuCas12a2 を既存の単一エフェクターベースのツールと同等の検出限界で RNA 検出に再利用できることを示しました 46。 RNA を検出する機能を超えて、CRISPR ベースのツールキットを拡張および強化するさまざまな SuCas12a2 アプリケーションを想定しています。 RNA 誘発 dsDNA 切断により、微生物群集のプログラム可能な形成、がん治療、ゲノム編集を強化するための逆選択など、さまざまな用途で原核細胞および真核細胞のプログラム可能な死滅が可能になる可能性があります。さらに、Cas12a2 と Cas12a は、同じ crRNA 配列を使用しながら、異なる核酸種 (RNA 対 ssDNA および dsDNA) を認識し、異なる非特異的切断活性を誘発する能力 (ssRNA、ssDNA および dsDNA (Cas12a2) 対 ssDNA (Cas12a)) Cas12a2 を組み込むことで、既存の Cas12a アプリケーションを拡張できます。 SuCas12a2 とそのオルソログの特性をさらに調査することで、広く社会に利益をもたらす可能性のある新しく改良された CRISPR 技術の出現が期待されます。

いくつかの Cas12a2 配列が最初に同定され、暫定的に Cas12a ヌクレアーゼをコードするものとして分類されました 16。これらの Cas12a2 タンパク質配列は、NCBI のタンパク質データの BLASTp 検索、および NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) および JGI (https://img.jgi) のメタゲノムデータの tBLASTn 検索のシードとして使用されました。 .doe.gov) を使用して、追加の推定 Cas12a2 ヌクレアーゼを特定します。

Cas12a2、Cas12a、および Cas13b オーソログのアミノ酸配列は、MAFFT (v.7.490)53 を使用してアラインメントされました。結果のアライメントは、ClipKIT54 を使用してトリミングされ、RAxML-NG55 と次のパラメータを使用して最尤系統を作成するために使用されました: --model JTT+G --bs-metric fbp, tbe --tree pars{60}, rand{60 --seed 12345 --bs-trees autoMRE。 Cas13b 配列をアウトグループとして使用しました。系統発生の作成に使用されたアミノ酸配列は補足ファイル 1 に提供されています。

SuCas12a2 の保存されたモチーフは、MOTIF Search (https://www.genome.jp/tools/motif/、2021 年 6 月 15 日にアクセス) および Phyre 256 (2021 年 3 月 8 日にアクセス) を使用して同定されました。 Cas12a2 オーソロガスアミノ酸配列の HHpred 二次構造予測を実行して、Cas12a257 の crRNA プロセシング部位を予測する Cas12a2 と Cas12a の間の共通の二次構造を特定しました。

別段の指示がない限り、すべての in vivo 実験は大腸菌 BL21(AI) で実施されました。増殖のために、培養物を 225 ～ 250 rpm で一定に振盪しながら 37 °C の LB 培地で増殖させました。プラスミドクローニングには大腸菌株TOP10を使用しました（補足表1（タブ1））。特に明記しない限り、すべてのプライマー、gBlock、およびオリゴは Integrated DNA Technologies から入手しました。プラスミド構築のギブソンアセンブリは、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs、E2621) を使用して実行されました。小さな挿入およびヌクレオチド置換を含むプラスミドの突然変異誘発は、Q5 部位特異的突然変異誘発キット (New England Biolabs、E0554S) を使用して実行されました。特に明記しない限り、ヌクレアーゼはすべて、crRNA とともに、p15A 複製起点およびクロラムフェニコール耐性マーカーを含むプラスミドから発現されました。ヌクレアーゼおよびcrRNAの発現は、特に指定しない限り、T7プロモーターによって制御されました。標的および非標的プラスミドのすべては、特に指定しない限り、プロトスペーサー配列および対応する隣接配列を、カナマイシン耐性カセットを有するpBR322またはsc101複製起点プラスミドに導入することによって作製した。 Cas12a2 オーソログ (補足ファイル 1) をコードする配列は、Genscript によってコドン最適化され、合成されました。 P. ブライアンティ B14 由来の Pb2Cas12a (NCBI: WP_039871282)、L. バクテリウム ND2006 由来の LbCas12a (NCBI: WP_035635841.1)、フランシセラツラレンシス由来の FnCas12a (NCBI: WP_104928540.1)、AsCas12 をコードする配列アシダミノコッカス属由来のａ。 Moraxella bovoculi 由来の BV3L6 (NCBI: WP_021736722.1) および Mb3Cas13a (NCBI: WP_080946945.1)16 は、大腸菌での発現用にコドンが最適化され、Integrated DNA Technologies から gBlock として注文されました。抗 CRISPR タンパク質 36、38 (補足表 1 および 3) をコードする配列は、大腸菌での発現用にコドン最適化され、Integrated DNA Technologies から gBlock として注文されました。次に、acr 遺伝子を PCR 増幅し、アンピシリン耐性カセットを保持する pBAD24 プラスミド骨格に導入しました 58。 LsCas13a をコードするプラスミド pCBS2091 は、Addgene (79150)8 から注文しました。大腸菌 BL21(AI) における RecA 依存性 SOS 応答を検出するために、GFP コード遺伝子の上流、予測される LexA 結合部位の 100 bp 上流に含まれる recA プロモーターを導入することにより、レポータープラスミド pCBS2000、pCBS3611 および pCBS3616 を作成しました。プラスミドpCBS198に導入します。プラスミド pCBS3611 および pCBS3616 は、プラスミド pCB67224 からアンピシリン耐性カセットを受け取りました。 recA プロモーター配列は、大腸菌 BL21(AI) のゲノムの位置 2,635,525 と 2,635,347 の間で同定されました (NCBI: CP047231.1)。ＧＦＰレポーター遺伝子を含まない対照プラスミドｐＣＢＳ３６１６およびｐＣＢＳ２００２は、ｐＣＢＳ２０００およびｐＣＢＳ３６１６のＰＣＲ増幅、その後のＫＬＤアセンブリ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｍ０５５４）によって生成した。プラスミドマップへのリンクを含む、研究で使用されたプラスミドの完全なリストは、補足表1および2に提供されます。関連するオリゴヌクレオチド、dsDNAおよびRNA配列のリストは、補足表1および3に提供されます。

N末端6×Hisタグ付きSuCas12a2 WTおよび変異体構築物を、(apo)を欠くか(プラスミド1416)、または3つのスペーサーCRISPRアレイ(crRNA誘導)を含むpACYCプラスミドから大腸菌Nico21(DE3)細胞で発現させた。 (プラスミド 1408) 自己誘導またはイソプロピル β-d-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) 誘導のいずれかを使用します。自己誘導増殖は、以前に報告されたガイドラインに従って実行されました59。簡単に説明すると、推奨濃度の ZY 培地、MgSO4、金属混合物、5052 (0.5% グリセロール、0.05% グルコース、0.2% α-ラクトース)、および NPS 自己誘導緩衝液と、選択に必要な抗生物質を含む溶液に、グリセロール由来の細菌を接種しました。ストックまたは新たな変革。細胞を約250 rpmで振盪しながら37℃で5時間増殖させ、その後24℃に移して24時間インキュベートした後、8,000 rpmで25分間遠心分離して回収した。次いで、細胞ペレットを精製するまで-80℃で保存した。 IPTG誘導のために、1μlのTB培地に20mlの一晩増殖液を接種し、600nmでの光学密度(OD600)が0.6になるまで37℃で増殖させた。次に細胞を氷上で 15 分間コールドショックし、0.1 mM IPTG で誘導し、その後 18 °C で 16 ～ 18 時間インキュベートしました。細胞を遠心分離により収集した。細胞を、ロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチン、AEBSFおよびリゾチームの存在下、溶解緩衝液（25 mM Tris pH 7.2、500 mM NaCl、10 mMイミダゾール、2 mM MgCl2、10%グリセロール）中で超音波処理することによって溶解した。溶解物を36,400gで35分間遠心分離することにより清澄化した。清澄化したライセートを 5 ml の Ni-NTA 樹脂に添加し、4 °C で 30 分間バッチ結合させた後、100 ml の溶解バッファーで洗浄しました。タンパク質を５０ｍｌのＮｉ溶出緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．２、５００ｍＭＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、２ｍＭＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）で溶出した。 SuCas12a2を含む画分を、Hiprep 26/10脱塩カラムを使用して低塩緩衝液(25mM Tris-pCas12a22、50mM NaCl、2mM MgCl2、10%グリセロール)中で脱塩した。次に、SuCas12a2 + crRNA を Hitrap Q HP カラム陰イオン交換カラムに適用し、一方、apo SuCas12a2 を Hitrap SP HP 陽イオン交換カラムに適用しました。カラムを１０％高塩緩衝液（２５ｍＭトリスｐＨ７．２、１ＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）で洗浄し、続いて１００％高塩緩衝液１０ＣＶ（５０ｍｌ）への勾配溶出を行った。 SuCas12a2を含む画分を、100 kDa MWKO濃縮器を使用して約1 mlに濃縮し、次いでSEC緩衝液(100 mM HEPES pH 7.2、150 mM KCl、 2 mM MgCl2、10% グリセロール)。 SuCas12a2 を含む画分を濃縮し、-80 °C で保存しました。

3x pre-crRNA の処理のために、HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs) を使用して、SuCas12a2 pre-CRISPRx3 RNA をインビトロ転写しました。テンプレート DNA は、KpnI 制限酵素で直線化された Jackson Laboratory プラスミド 1409 に由来しました。約 130 ヌクレオチドにある汚染バンドが反応のアーチファクトであることが観察されました。この汚染バンドの転写を防ぐために多くの戦略が試みられましたが、成功しませんでした。インビトロ転写されたＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して洗浄された。次に、1.5 μM のアポ SuCas12a2 を、New England Biolabs の 1 × 3.1 バッファー (100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、100 mg ml-1 BSA) 中で 1 mg の SuCas12a2 pre-CRISPRx3 RNA とインキュベートしました。 pH 7.9) を使用し、25 °C でさまざまな時間インキュベートしました。サンプルを、ssRNA 低域ラダー (New England Biolabs) に沿ってゲル (12% ポリアクリルアミド、8 M、TBE) 上で泳動し、SYBR gold (Thermo Fisher Scientific) で染色しました。

WT および crRNA プロセシング変異体による 1x crRNA のプロセシングについては、13 塩基の 5 ' 未プロセシングオーバーハングを持つ合成 crRNA (smcrRNA; 補足表 1 および 3) を、以前に概説したプロトコル 60 を使用してリフォールディングしました。 10μlの反応では、150nMのcrRNA基質をNEB 3.1の1.5μMのWT、K784AまたはK785AアポSuCas12a2タンパク質と組み合わせた。反応物を 37 °C で 1 時間インキュベートしました。反応をフェノールでクエンチし、フェノール-クロロホルム抽出を実行しました。結果は、SYBR Gold で染色された 12% 尿素 PAGE を使用して分析されました。

標的切断の分析のために、1× NEB 3.1 バッファー中の 250 nM SuCas12a2-crRNA と 100 nM の相補的な FAM 標識合成オリゴヌクレオチド (ssDNA、dsDNA または RNA) の反応液 10 μl を 37 °C で 1 時間インキュベートしました。。反応をフェノールでクエンチし、次にフェノール-クロロホルム抽出を実行しました。結果は、以前に概要を説明した FDF-PAGE 法 61 を使用して分析し、フルオレセイン蛍光について視覚化しました。

側副切断の分析には、250 nM SuCas12a2-crRNA、250 nM の標的 (crRNA ガイドに相補的な RNA) または非標的 (crRNA ガイドに非相補的な RNA) 基質、および 100 nM 1×NEB 3.1中の5'-FAM標識側副基質（ssDNA、dsDNA、RNA）を37℃で1時間インキュベートしました。反応をフェノールでクエンチし、次にフェノール-クロロホルム抽出を実行しました。結果は 12% 尿素 – PAGE を使用して分析され、フルオレセイン蛍光で視覚化されました。

活性化に必要なフランキング配列の分析には、250 nM Cas12a2-crRNA と 300 nM の異なる標的 ssRNA (自己 (crRNA の直接反復に相補的な配列が隣接)、フランクなしおよびフランクを含むフランク) を含む 10 μl 反応物を使用します。プロトスペーサーの3'側の5'-GAAA-3' PFS）および1×NEB 3.1緩衝液中の100nMの側副5'-FAM dsDNAを37℃で1時間インキュベートした。反応をフェノールでクエンチし、フェノール-クロロホルム抽出を実行しました。結果は 12% 尿素 – PAGE を使用して分析され、フルオレセイン蛍光で視覚化されました。

側副切断の動態解析では、100 nM Cas12a2-crRNA、100 nM の標的 ssRNA (crRNA 相補的)、および 100 nM の異なる 5'-FAM 標識側副基質 (ssDNA、dsDNA、RNA) を 1x に含む単一 100 μl 反応液を使用します。 NEB 3.1 バッファが作成されました。 100 μl の反応液から 10 μl をフェノールと混合し、次にフェノール-クロロホルム抽出を実行することにより、1、2、5、10、15、30、60、120 および 180 分の時点でタイムポイントを取得しました。結果は 12% 尿素 – PAGE を使用して分析され、フルオレセイン蛍光で視覚化されました。

プラスミド切断アッセイでは、1x NEB 3.1 緩衝液中に 14 nM Cas12a2-crRNA、25 nM 標的 RNA、7 nM の pUC19 プラスミドを含む 100 μl 反応液を 37 °C でインキュベートしました。示された時点で、反応液 10 μl を取り出し、フェノールでクエンチし、フェノール-クロロホルム抽出を実行しました。反応は臭化エチジウムを含む 1% アガロース上で視覚化されました。

EnGen LbaCas12a (LbCas12a) は New England Biolabs (M0653S) から購入しました。 1×NEB 2.1緩衝液中に250 nMのLbCas12aおよび500 nMの同族crRNAを含む反応液（10μl）を、200 nMの異なる標的基質（ssDNA、dsDNA、RNA）および100 nMの異なるFAMとともに37℃でインキュベートしました。標識された側副基質 (ssDNA、dsDNA、RNA)。 1 時間後、反応をフェノールでクエンチし、フェノール-クロロホルム抽出を実行しました。結果は 12% 尿素 – PAGE を使用して分析され、フルオレセイン蛍光で視覚化されました。

LwCas13a は MCLAB Molecular Cloning Laboratories から購入しました (Cas13a-100)。付属の 1× Cas9 緩衝液 (20 mM HEPES (pH 6.5)、5 mM MgCl2、100 mM NaCl、100 μM EDTA) 中に 250 nM の LwCas13a および 500 nM の同族 crRNA を含む反応液 (10 μl) を 37 °C でインキュベートしました。２００ｎＭの異なる標的基質（ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ）および１００ｎＭの異なるＦＡＭ標識側副基質（ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ）を含むＣ。 1 時間後、反応をフェノールでクエンチし、フェノール-クロロホルム抽出を実行しました。結果は 12% 尿素 – PAGE を使用して分析され、フルオレセイン蛍光で視覚化されました。

AbCas12g は、pET28a-mH6-Cas12g1 (Addgene プラスミド、120879) を使用して大腸菌 NiCo 21 DE3 で発現させ、最初に前述のように精製しました 25。次にタンパク質を緩衝液交換によって低塩緩衝液（25 mM HEPES pH 7.8、50 mM NH4Cl、2 mM MgCl2、7 mM BME、5% グリセロール）に移し、ヘパリン上にロードし、続いて直線的な NaCl 勾配で溶出しました。前述のゲル濾過62．精製したタンパク質を急速冷凍し、-80 °C で保存しました。 Cas12g1 非コードプラスミド pACYC-Cas12g1 (Addgene プラスミド、120880) を、2× Taq Master Mix (New England) 中で Cas12gtracrRNA F および R プライマー (補足表 1 および 3) を使用した AbCas12g tracrRNA 配列の PCR 増幅のテンプレートとして使用しました。バイオラボ）。非コードプラスミドを、DpnI を用いて、CutSmart バッファー (New England Biolabs) 中で 37 °C で 1 時間インキュベートして除去しました。 DNA 成分は、EZNA Cycle Pure Kit (OMEGA BioTek) を使用して PCR および DpnI 消化後に洗浄されました。 Cas12g tracrRNA は、HighScribe T7 Quick High Yield RNA 合成キットを使用して転写し、Monarch RNA クリーンアップキット (New England Biolabs) を使用して精製しました。 1×NEB 3.1緩衝液中に250nMのCas12g、500nMのCas12g crRNA、および1μMのCas12g tracrRNAを含む反応液（10μl）を、200nMの異なる標的基質（ssDNA、dsDNA）とともに37℃または50℃でインキュベートしました。、ＲＮＡ）および１００ｎＭの異なるＦＡＭ標識側副基質（ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ）。 1 時間後、反応をフェノールでクエンチし、フェノール-クロロホルム抽出を実行しました。結果は 12% 尿素 – PAGE を使用して分析され、フルオレセイン蛍光で視覚化されました。

SuCas12a2 側副基質を分析するには、250 nM の Cas12a2-crRNA、200 nM の異なる標的基質 (ssDNA、dsDNA、ssRNA)、および 100 nM の異なる FAM 標識側副基質 (ssDNA、dsDNA、RNA) を 1x で含む 10 μl 反応液を使用します。 NEB 3.1 バッファーを 37 °C で 1 時間インキュベートしました。反応をフェノールでクエンチし、フェノール-クロロホルム抽出を実行しました。結果は 12% 尿素 – PAGE を使用して分析され、フルオレセインについて視覚化されました。

Cas12a2 (100 nM) は、RNase または DNase Alert (200 nM、IDT) およびターゲット RNA を 384 ウェルプレートで指定の濃度に調製します (Greiner Bio-One、784077)。バックグラウンドコントロールは、標的 RNA の代わりにヌクレアーゼフリーの水で調製されました。反応は、周囲条件 (室温) または 37 °C のいずれかで、レポーター蛍光 (RNase アラート: 励起 485-20/発光 528-20、DNAse アラート: 励起 500-20/発光 560-20) を経時的にモニタリングしました。 Synergy H4 ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー (BioTek Instruments)。 GraphPad PRISM を使用して、標的 RNA の各濃度での直線領域の傾き (5 ～ 30 分の間) を決定しました。線形フィットの標準誤差は標準偏差の代用として使用され、検出限界は前述のように水のバックグラウンドの標準誤差の 3 倍として計算されました 46。検出限界は、V0 (相対蛍光単位 (RFU)/秒) 対標的 RNA の濃度のプロットが検出閾値と交差する場所を決定することによって推定されました。

プラスミド切断反応は、NEB 3.1 バッファー (50 mM Tris-HCl pH 7.9、100 mM NaCl、10 mM MgCl2、100 μg ml-1 BSA) 中で 14 nM SuCas12a2 (または変異体) を 14 nM crRNA および 25 mM 標的 RNA と組み合わせることによって調製しました。）。 7 nM スーパーコイル pUC19 プラスミドを添加する前に、タンパク質を 37 °C で 15 分間予熱しました。サンプルを 1、2、5、10、20、30、45、および 60 分の時点で取り出し、pH 8.0 のフェノール - クロロホルムでクエンチしました。クエンチした反応物を、はじいて遠心分離することによって混合した。サンプルを 1% アガロースゲルにロードし、臭化エチジウムを使用して視覚化しました。ゲルは、ChemiDoc MP Image System (Bio-Rad) を使用して画像化されました。

プラスミド pSPC421 は、Zymo Research の ZymoPURE II Plasmid Midiprep Kit (D4201) を使用して TOP10 E. coli 細胞から収集し、Zymo Research の DNA Clean & Concentrator-5 キット (D4013) を使用して洗浄しました。 ca33Cas12a2はプラスミドpCBS5042から発現され、Rudolf Virchow Center for Integrative and Translational Bioimagesにおいて上記のように精製された。 ca33Cas12a2 ヌクレアーゼ (100 nM) を crRNA (1 μM) とともに NEB3.1 バッファー中で室温で 30 分間インキュベートしました。 CAO1 標的 RNA (1 nM) および pSPC425 (3 μg) を反応媒体に 15 分間添加しました。プラスミドのニッキングを評価するために、サンプルを 80 °C で 1 ～ 30 分間加熱しました。反応は 0.8% アガロースゲル上で実行されました。 DNA ポリメラーゼ I (NEB、M0209L) を、Atto425 NT ラベリングキット (Jena Bioscience、PP) の Atto421-NT ラベリングミックス (1x) および NT ラベリングバッファー (1x) を含む反応液 (0.2 U μl-1) に添加しました。 -305S-425）。サンプルは、Bio-Rad サーモサイクラー内で 15 °C で 90 分間インキュベートされました。得られた標識DNA断片をMicrospin S-400 HRカラム(Cytiva、27514001)を使用して精製した。蛍光測定 (𝛌exc = 436 nm; 𝛌em = 484 nm) は、蛍光マイクロタイタープレートリーダー (BioTek NeoG2) を使用して 25 °C で実行されました。

ヌクレアーゼおよびcrRNAコード配列を含むSuCas12a2発現プラスミドpCBS3568およびcrRNAを含まない対照pCBS3569を大腸菌BL21(AI)に形質転換し、形質転換体を選択プレート上にプレーティングした。得られたコロニーを採取し、2mlの液体培養物に一晩接種するために使用した。翌日、一晩培養物を使用して、ＯＤ６００が約０．０５になるまでクロラムフェニコールを含有するＬＢ２５ｍｌに接種した。約 40 分後に増殖培養物が 0.25 の OD600 に達したら、ヌクレアーゼと crRNA の発現を 1 mM IPTG と 0.2% L-アラビノースで誘導しました。誘導された培養物は、14,000 rpm、4 °C で 2 分間の遠心分離によって定常期に収集されました。次に、細胞ペレットを液体 N2 中で直ちに凍結し、さらに処理するまで -80 °C で保存しました。

メーカーの指示に従って、Direct-zol RNA Miniprep Plus (Zymo Research、R2072) を使用して、細胞ペレットから全RNAを精製しました。 Turbo DNase (Life Technologies、AM2238) を使用して DNA を除去しました。個々の処理ステップの間に、RNA Clean & Concentrator キット (Zymo Research、R1017) を使用して RNA を精製しました。リボソーム RNA は、RiboMinus Transcriptome Isolation Kit、細菌 (Thermo Fisher Scientific、K155004) を使用してサンプルから除去されました。 3'-ホスホリル基は、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs、M0201S)を使用してRNAから除去した。 cDNA合成およびライブラリーの調製は、イルミナ用NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set (New England Biolabs、E7330S)を使用して実行されました。 200 bp ～ 700 bp のフラグメントのサイズ選択は、Select-a-Size DNA Clean & Concentrator キット (Zymo Research、D4080) を使用して実行されました。最後に、AMPure XP ビーズ (Beckman Coulter、A63882) を使用して DNA を精製し、DeNovix DS-11 FX (DeNovix) で Qubit dsDNA HS アッセイキット (Thermo Fisher Scientific、Q32851) を使用して定量しました。

ライブラリーの配列決定は、MiSeq 300 配列決定法 (Illumina) を使用して、ドイツのブラウンシュヴァイクにあるヘルムホルツ感染症研究センター (HZI) GMAK 施設で実施されました。結果として得られたペアエンドリードは、BBTools63 (https://sourceforge.net/projects/bbmap/) を使用して品質管理され、トリミングおよびマージされました。次に、Bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/) を使用して、リードを pCBS273 のプラス鎖上の crRNA 発現部位にマッピングしました。関連する生の配列データと処理された配列データ、およびデータ処理ステップは、NCBI Gene Expression Omnibus (GEO: GSE178531) で見つけることができます。

標準的なプラスミドクリアランスアッセイを、ヌクレアーゼおよび crRNA 発現プラスミドを含む大腸菌 BL21(AI) で実施しました。細菌培養物を一晩増殖させ、クロラムフェニコールを含む新鮮なLB培地にOD600が0.05〜0.1になるまで接種するために使用しました。続いて、これらの培養物をＯＤ６００が約０．２５に達するまで増殖させ、その時点で１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．２％の１−アラビノースを添加して誘導した。培養物の OD600 が 0.6 ～ 0.8 に達したら、細胞を収集し、エレクトロコンピテント 64 にしました。エレクトロコンピテント細胞は、4 つの生物学的複製から調製されました。直後、50 ng μl -1 の標的および非標的プラスミドの1 μlを、エレクトロコンピテント大腸菌細胞50 μlにエレクトロポレーションした。高い形質転換効率を達成するために、使用したプラスミドをエタノール沈殿によって精製し、Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific、Q32851) を使用して定量しました。エレクトロポレーションされた細胞は、抗生物質を含まず、1 mM IPTGおよび0.2% l-アラビノースを含む500 μl LB中で振盪しながら37℃で1時間回収されました。次に、培養物を 10 倍ずつ 10-5 まで連続的に希釈しました。次に、ヌクレアーゼ crRNA および標的/非標的プラスミドを選択するために、各希釈液 5 ～ 10 μl を抗生物質を含む LB プレート上にスポットしました。プレートには、0.3 mM IPTGおよび0.2% 1-アラビノースも含まれていました。プレートを 37 °C で一晩インキュベートしました。

翌日、コロニーを手動でカウントし、得られたカウントを希釈率に合わせて調整しました。最も高い計数可能な希釈からのカウントを使用して、非標的条件のコロニーを標的条件のコロニーで割った比率として形質転換倍率減少を計算した。

細胞自殺表現型を決定するために使用されるアッセイの修正では、まず標的プラスミドと非標的プラスミドを大腸菌 BL21(AI)に形質転換しました。次に、これらの細胞をエレクトロコンピテントにし、最後にヌクレアーゼ crRNA プラスミドを形質転換しました。

Acr をテストする場合、Acr プラスミド (アンピシリン) とヌクレアーゼ crRNA プラスミド (クロラムフェニコール) を同時形質転換し、続いて標的または非標的プラスミド (カナマイシン) をエレクトロポレーションしました。

ヌクレアーゼ標的条件下での培養物の増殖を調査するために、ヌクレアーゼ crRNA および標的/非標的プラスミドを大腸菌 BL21(AI) に形質転換しました。得られた形質転換体をSOC培地で回収し、0.2%グルコースで一晩増殖させてヌクレアーゼおよびcrRNAの発現を阻害した。朝、5,000gで2分間遠心分離して細胞を収集しました。ペレットをLBに再懸濁し、96ウェルプレート上の200μlのLB培地に最終OD600が0.01になるまで接種するために使用した。実験に応じて、反応には抗生物質、IPTG、L-アラビノースのさまざまな組み合わせが含まれていました。プレートを BioTek Synergy H1 プレートリーダー内で 37 °C で激しく振盪しながらインキュベートしました。培養物の OD600 を 3 分ごとに記録しました。プラスミドクリアランスアッセイは、上記のように一晩培養物を用いて実施した。

SuCas12a2 の PFS 優先性を決定するために、PFS 枯渇アッセイを実施しました。 5 ヌクレオチドの PFS コード部位の代わりに 1,024 ヌクレオチドの組み合わせからなるオリゴライブラリー (ODpr23) が Integrated DNA Technologies によって合成されました。ＯＤｐｒ２３オリゴプールライブラリをプライマーＯＤｐｒ２４と組み合わせて使用し、ターゲティングプラスミドｐＣＢＳ２７６を、Ｑ５ポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｍ０５４３）を使用してＰＣＲ増幅した。 PCR産物は、Zymoclean Gel DNA Recovery Kit（Zymo Research、D4007）を使用してゲル精製し、KLD反応混合物（New England Biolabs、M0554）を使用してライゲーションしました。連結したプラスミドをエタノール沈殿を使用して精製し、大腸菌 TOP10 にエレクトロポレーションしました。合計 10 回のエレクトロポレーション反応を実行しました。 SOC培地中でエレクトロポレーションされた細胞を回収した後、個々の反応を合わせて、カナマイシンを含む90mlのLB培地に接種した。各エレクトロポレーション反応からの合計 10 μl を選択 LB 培地にプレーティングし、形質転換された細菌の総数を推定しました。コロニー数から、形質転換細胞の総数はライブラリー内の固有の PAM 配列の数 (1,024) を約 2,300 倍上回っていると推定されました。プラスミドライブラリーDNAを、ZymoPURE IIプラスミドミディプレップキット(Zymo Research、D4201)を使用して、合わせた一晩培養物から精製し、さらにエタノール沈殿によって精製した。次に、サンガー配列決定によってプラスミドライブラリーを検証した。

ＰＡＭプラスミドライブラリーを、ＳｕＣａｓ１２ａ２ヌクレアーゼ発現プラスミドｐＣＢＳ２７３または空のプラスミド対照ｐＣＢＳ３５６９のいずれかを含むエレクトロコンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＡＩ）に形質転換した。エレクトロコンピテントセルは上記のように調製した。約600 ngのプラスミドDNAを50 μl容量のコンピテントセルにエレクトロポレーションしました。形質転換細菌を500μlのSOC培地中で37℃で1時間回収し、カナマイシンおよびクロラムフェニコールの存在下で1mM IPTGおよび0.2％L-アラビノースを含む50ml LBに接種するために使用した。培養物を13時間増殖させた後、4,000gで15分間遠心分離して細胞を収集し、ZymoPURE IIプラスミドミディプレップキット(Zymo Research、D4201)を使用してプラスミドDNAを抽出した。回収後、細菌を、誘導物質を含まないカナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むLBプレートにも播種した。これらのプレートを使用して、プラスミドライブラリーで形質転換された細胞の総数を推定しました。コロニー数に基づいて推定された形質転換細胞の総数は、SuCas12a2-crRNA プラスミド (pCBS273) を含む細胞では、ライブラリー内の固有の PAM 配列の数を約 1,700 倍上回ったのに対し、crRNA を含まないコントロールでは 11,900 倍でした。 (pCBS3569)。

PFSをコードする配列を含む標的部位を含むプラスミドDNAの領域を、プライマーODpr55およびODpr56を使用してPCR増幅した。 PCR反応は、AMPure XPビーズ（Beckman Coulter、A63882）を使用して精製されました。精製された PCR 産物は、プライマー ODpr58、ODpr60、ODpr59、および ODpr61 を使用してインデックス付けされました。インデックス付き PCR 産物は、AMPure XP ビーズを使用して精製され、Qubit アッセイ (Thermo Fisher Scientific、Q32851) を使用して定量され、MiSeq PE300 Illumina シーケンスメソッドを使用する HZI GMAK 施設でのシーケンスのために送られました。

PFS エンコード配列枯渇データの分析と PFS ホイールの作成は、前述のように実行されました 65。 PFS コンセンサスモチーフは手動で定義されました。生の配列データと処理された配列データ、およびデータ処理手順は、NCBI GEO (GSE178530) で見つけることができます。個々の PFS 配列は、上記のプラスミドクリアランスアッセイを使用して検証されました。

Cas12a ヌクレアーゼの Acr 感受性を試験するための in vitro アッセイでは、Cas12a ヌクレアーゼをコードするプラスミドを、標的 crRNA または非標的 crRNA をコードするプラスミドと一緒に、9 μl の MyTXTL マスターミックス (Arbor Biosciences) 中で最終濃度 4 で事前発現させました。総量 12 μl 中の各プラスミドの nM。 Acrは、総量12μl中4nMの濃度で別々に事前発現させました。 Acr は線状 DNA フラグメントにコードされているため、DNA 分解を防ぐために最終濃度 2 μM の GamS を添加しました。すべての前発現は 29 °C で 16 時間実行されました。その後の切断アッセイは、各発現前反応液 1 μl を新鮮な myTXTL ミックス 9 μl に添加することによって実行されました。 deGFPタンパク質を構成的に発現するpCBS420プラスミドを、最終濃度1nMでレポーターとして使用した。定量化のために、反応あたり 4 つの 3 μl 複製を 96 ウェル V 底プレート (Corning Costar 3357) に移しました。反応物は、Echo 525 Liquid Handler (Beckman Coulter) を使用して調製されました。蛍光は、BioTek Synergy H1 プレートリーダーで測定しました (励起、485/20; 発光、528/20)。時間経過測定は、測定間隔を 3 分とし、29 °C で 16 時間実行しました。

プラスミドレポーターコンストラクトのすべての抑制倍数の値は、16 時間の反応後の非ターゲットの deGFP 濃度とターゲット crRNA の比を表します。 Acr の阻害活性を測定する実験では、次の式 66 に従って発現 16 時間後のエンドポイント発現値から阻害を計算しました: ヌクレアーゼ活性の阻害率 = 100 × (RFUt,Acr/RFUnt,Acr − RFUt,- /RFUnt,-)/(1 − RFUt,-/RFUnt,-)、ここでヌクレアーゼ活性の阻害 (%) は、GFP ターゲティング (t) と非ターゲティング (nt) Cas ヌクレアーゼ間の蛍光の比によって定義されます。 Acr の存在 (Acr) と不在 (-)。

RecA 依存性 SOS 応答を測定するために、ヌクレアーゼ crRNA、標的/非標的プラスミド (pCBS276/pCBS3578、カナマイシン)、およびレポーター PrecA-gfp/no-gfp (pCBS3611/pCBS3616、アンピシリン) プラスミドを E に形質転換しました。引き続き.coli BL21(AI)を使用します。プラスミド pCBS273 および pCBS3588 (クロラムフェニコール) を使用して、それぞれ SuCas12a2 および LbCas12a ヌクレアーゼを発現しました。 LsCas13aの存在下でRecA依存性SOS応答を測定する場合、ヌクレアーゼ発現プラスミドpCBS361（クロラムフェニコール）を使用した。標的/非標的プラスミド pCBS2004/pCBS612 (アンピシリン) および PrecA-gfp/no-gfp プラスミド pCBS2000/pCBS2002 (カナマイシン) を使用しました。まず、ヌクレアーゼおよび crRNA の発現を阻害するために、細胞を 0.2% グルコースを含む LB 培地で増殖させました。５，０００ｇで２分間遠心分離することによって一晩培養物（１５ｍｌ）から細菌を収集し、新鮮なＬＢ中に再懸濁した。次に、一晩培養したものから再懸濁した細菌を含む新鮮なLB培地200μlを96ウェルプレートに接種しました。これらの培養物は、クロラムフェニコール、カナマイシンおよびアンピシリン、クロラムフェニコールおよびアンピシリンの存在下、または抗生物質なしのいずれかの存在下で増殖させた。ヌクレアーゼおよびcrRNA発現の誘導のために、1 mMのIPTGおよび0.2%のL-アラビノースを添加した。

培養物は、37℃で激しく振盪しながら増殖させた。 OD600 および蛍光測定値 (励起: 485/20、発光: 528/20) を BioTek Synergy H1 プレートリーダーで 5 分ごとに収集しました。実験条件ごとに 4 つの生物学的複製を測定しました。

ヌクレアーゼターゲティングの結果として蛍光の変化が起こったかどうかを調べるために、まず、PrecA-no-gfp プラスミド (pCBS3616/pCBS2002) を含む培養物で収集されたバックグラウンド蛍光を、GFP 発現プラスミドを含む培養物で得られた値から差し引きました。各時点のプラスミド (pCBS3611/pCBS2000)。次に、蛍光値を、対応する標的および非標的培養物からの OD600 値で割りました。統計的有意性は、不等分散によるウェルチの t 検定を使用して決定されました。

並行して、上記のように、洗浄した一晩培養物を用いてプラスミドクリアランスアッセイを実行しました（補足図9b）。最低の播種希釈では、約 0.1 の OD600 の培養物を使用しました。

フローサイトメトリー測定では、大腸菌 BL21(AI) 細胞にヌクレアーゼをコードするプラスミドおよび標的/非標的プラスミドを連続的にエレクトロポレーションしました。 SuCas12a2発現プラスミドpCBS273、LbCas12a発現プラスミドpCBS3588をそれぞれ使用した。標的プラスミドpCBS273および非標的プラスミドpCBS3578を使用した。 LsCas13aを含む実験では、ヌクレアーゼ発現プラスミドpCBS361を標的プラスミドpCBS2004および非標的プラスミドpCBS612と組み合わせて使用した。プラスミド形質転換後、大腸菌をSOC培地で回収し、クロラムフェニコール、カナマイシンおよび0.2%グルコースを含むLB中で一晩増殖させた。次に、細胞を5,000gで2分間収集し、新鮮なLBに再懸濁しました。再懸濁した細菌を使用して、15 mlの培養物にOD600が約0.01になるまで接種した。これらの培養物を、抗生物質を使用せずに、1 mM IPTGおよび0.2% L-アラビノースを用いて、220 rpmで振盪しながら37℃で6時間増殖させた。 2 時間ごとに培養物の OD600 を測定し、500 μl のサンプルを収集し、5,000 g で 3 分間遠心分離しました。次いで、細胞ペレットを、２μｇｍｌ－１のＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、６２２４８）を含有する１×ＰＢＳ中に再懸濁した。再懸濁した細胞を暗所で10分間染色し、その後10μlを96ウェルプレート上の240μlの1×PBSに移した。 DAPI 蛍光は、Cytoflow Novocyte Quanteon フローサイトメーターを使用して、パシフィックブルースペクトル (455 nm) の発光として測定されました。前方散乱光 (FSC) および側方散乱光に関するデータも収集されました。

結果として得られたデータは Python で分析されました。まず、ノイズのあるアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリングを使用して、明確な FSC シグナルとパシフィックブルーシグナルを示す細菌のクラスターを特定しました (DBSCAN; https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.cluster.DBSCAN.html) ）。次に、各データポイントのパシフィックブルーと FSC 信号の比率、および各クラスター内のデータポイントの割合がクラスターデータから解析されました。結果の値はバルーンプロットの形式でプロットされました。サンプルごとに合計 60,000 件のイベントが分析されました。

死菌および生菌は、LIVE/DEAD BacLight 細菌生存率および計数キット (Molecular Probes、L34856) を使用して推定されました。測定は、Cytoflow Novocyte Quanteon フローサイトメーターを使用して実行されました。大腸菌 BL21(AI) 細菌をヌクレアーゼ、crRNA、および標的または非標的発現プラスミドで形質転換しました。ターゲットガイドを用いてSuCas12a2およびLbCas12aを発現させるために、それぞれプラスミドpCBS273およびpCBS3588を使用した。標的発現プラスミドpCBS2004および非標的発現プラスミドpCBS612を使用した。標的ガイドおよび非標的ガイドを用いてLsCas13aを発現させるために、それぞれプラスミドpCBS273およびpCBS3578を使用した。ヌクレアーゼガイドとターゲットプラスミドの組み合わせを含む培養物を、4 つの生物学的複製で 0.2% グルコース阻害剤を使用して約 16 時間増殖させました。次に、5,000gで3分間遠心分離することによって各培養物1mlを収集した。得られたペレットを1mlの新鮮なLB培地に再懸濁した。この懸濁液の合計60μlを使用して、20mlのLBに接種した。 3 つの培養物を 220 rpm で一定に振盪しながら 37 °C で 2 時間増殖させました。ヌクレアーゼとガイドの発現は、0.2% アラビノースと 0.01 mM IPTG で誘導されました。 4時間後、培養物のOD600を測定した。 OD600 1.0 に相当する培養液を収集し、キットのマニュアルに記載されているように処理しました。簡単に説明すると、細菌培養物のサンプルを 10,000g で 3 分間遠心分離して細胞をペレット化しました。上清を除去し、ペレットを1 mlの0.85% NaClに再懸濁した。死細胞の対照として、スペクトテートペレットを最初に300μlの0.85% NaClに再懸濁し、次に700μlの70%イソプロピルアルコールに再懸濁した(死細胞懸濁液)。サンプルを室温で 60 分間、15 分ごとに混合しながらインキュベートしました。次に、サンプルを 10,000g で 3 分間遠心分離し、1 ml の 0.85% NaCl で洗浄し、さらに遠心分離しました。最後に、サンプルを０．５ｍｌの０．８５％ＮａＣｌ中に再懸濁した。細胞染色用のマスターミックス 1 ミリリットルには、977 μl の 0.85% NaCl、1.5 μl の成分 A (3.34 mM SYTO 9 核酸染色)、1.5 μl の成分 B (30 mM ヨウ化プロピジウム (PI))、10 μl が含まれていました。成分 C (ビーズ) と 10 μl のサンプル。これらの反応物を光から保護して室温で15分間インキュベートした。蛍光は、緑 (SYTO 9 の場合はフルオレセイン) および赤 (PI の場合はテキサスレッド) チャネルで収集されました。各サンプル中の死細胞は、イソプロピルアルコールで処理された死細胞懸濁液対照に基づいてゲートされた。 PIで染色された死細胞の割合は、ビーズを使用しないイベントの総数から計算されました。サンプルごとに合計 50,000 のイベントがカウントされました。

上述のように、死滅/生染色用に増殖させたOD600 0.4の培養液1 mlに相当するサンプルを収集し、10,000gで3分間遠心分離した。得られたペレットを液体窒素中で凍結し、さらに処理するまで -80 °C で保存しました。メーカーの指示に従って、Direct-zol RNA Miniprepキット(R2051、Zymo)を用いて1.5mlのTrizolおよび1.5mlのエタノールを使用して全RNAを抽出した。 RNA Clean & Concentrator-5 キット (R1013、Zymo) を使用して RNA をさらに精製しました。各サンプルからの 5 μl 中の合計 0.5 μg の RNA を 2.5 μl の RNA ローディング色素と組み合わせ、70 °C に 10 分間加熱し、その後氷上で 2 分間冷却しました。使用したRNA High-Rangeラダーも熱処理したものです。変性サンプル (5 μl) とリーダー (3 μl) を 1% TBE ゲルにロードしました。ゲルを１２０Ｖで４０分間泳動した。次に、ゲルを臭化エチジウム中で３０分間染色し、１０ｍｌで洗浄し、画像化した。ゲル画像は、GelAnalyzer v.19.1 (www.gelanalyzer.com) を使用して分析しました。

共焦点顕微鏡の場合、フローサイトメトリーについて上述したように細胞を増殖させた。 2 時間間隔で、各培養液 500 μl を収集し、5,000 g で 3 分間遠心分離しました。次に、細菌をほぼ同じ細胞密度に希釈し、2 μg ml-1 の FM4-64 色素 (Thermo Fisher Scientific、T13320) および 1 μg ml-1 の DAPI (Thermo Fisher Scientific、62248) で染色しました。イメージングは、Leica DMi6000B TCS-SP5 II 倒立共焦点顕微鏡を使用して倍率 1,000 倍で実行されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

PAM 枯渇アッセイからの NGS データと crRNA 配列決定データは、アクセッションコード GSE178536 で NCBI GEO に寄託されました。記事および補足情報の調査結果を裏付けるその他すべてのデータは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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Cas12a2 の命名に関する指導と系統解析に関するフィードバックをいただいた K. Makarova に感謝します。 L. Fläxl は転写と翻訳を支援してくれました。 L. Ostertag はニック翻訳を手伝ってくれました。 F. Ttofali にはプラスミドのクローニングとテストを支援していただきました。 D. Collias にニック翻訳に関する提案を提供していただきました。 A. Pawluk と A. Özcan には原稿に関するフィードバックを提供していただきました。プラスミド pET28a-mH6-Cas12g1 (Addgene プラスミド、120879) および pACYC-Cas12g1 (Addgene プラスミド、120880) は Arbor Biosciences から贈呈されました。プラスミド pC001 は F. Zhang から贈られたものです (Addgene プラスミド、79150)。この研究は、ERC Consolidator 助成金 (CLB への 865973)、DARPA Safe Genes プログラム (CLB への HR0011-17-2-0042)、国立衛生研究所 (RNJ への R35GM138080)、オランダ科学研究機構 ( NWO)、ルビコン助成金 (プロジェクト 019.193EN.032、IM 宛)、および連邦破壊的イノベーション庁 (CLB 宛) を通じて。表明された見解、意見、および/または調査結果は、国防総省または米国政府の公式見解または政策を表すものとして解釈されるべきではありません。

Helmholtz Center for Infection Research GmbH (HZI) によって提供されるオープンアクセスの資金提供。

ベンジャミン・N・グレイ

現在の住所: シンジェンタ、リサーチトライアングルパーク、ノースカロライナ州、米国

ヘルムホルツ RNA ベース感染研究研究所、ヘルムホルツ感染研究センター、ヴュルツブルク、ドイツ

オレグ・ドミトレンコ、エレナ・ヴィアレット、ヨアニス・ムギアコス、カタリーナ・G・ワンデラ、ヨハネス・ウェーバー、トーマス・ゴーディン、チェイス・L・バイゼル

ベンソンヒル、セントルイス、ミズーリ州、米国

ジーナ・C・ニューマン、ベンジャミン・N・グレイ、マシュー・B・ベゲマン

ユタ州立大学化学生化学学部、ローガン、ユタ州、米国

トムソン・ホールマーク、ディラン・J・カイザー、ヴァレリー・M・クロウリー、ハンナ・ドムガード、ジョシー・メトカーフ、ライアン・N・ジャクソン

ヴュルツブルク大学医学部、ヴュルツブルク、ドイツ

チェイス・L・バイゼル

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概念化: OD、GCN、RNJ、および CLB 方法論: OD、GCN、VMC、JM、HD、TH、および DJK Cas12a2 オーソログのバイオインフォマティクスによる発見: BNG および OD 細菌性流産感染の最初の観察: GCN 系統解析: OD RNA ターゲティングの発見: OD、DJK、RNJ、CLB 大腸菌での実験: OD、GCN、VMC、EV、IM、JW 転写翻訳の実験: KGW、JW、OD インビトロでの実験: VMC、DJK、HD、TH、JM Nick-翻訳診断: TG 執筆 - 原案: OD、VMC、RNJ および CLB 執筆 - レビューおよび編集: 著者全員。ビジュアライゼーション：OD、DJK、TH、HD、RNJ、CLB 監修：MBB、RNJ、CLB 資金調達：RNJ、CLB

Matthew B. Begemann、Ryan N. Jackson、または Chase L. Beisel との通信。

Benson Hill は 1 件の特許を取得しており (米国 9,896,696)、追加の特許出願を行っています。 GCN と MBB は Benson Hill の従業員です。 OD、RNJ、および CLB は、関連する概念に関する仮特許出願を提出しており、1 件の特許が付与されました (米国 9,896,696)。 CLB は Locus Biosciences の共同創設者であり、Benson Hill の科学諮問委員会のメンバーでもあります。他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Raymond Staals と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

アミノ酸配列を使用して生成された系統樹は、図 1a の注釈付きバージョンです。影付きの領域は、Cas12a2 (赤色)、Cas12a (青色)、および Cas12b (灰色) オルソログを示します。青と赤の黒丸は、Cas12a2 と Cas12a の両方を含むシステムを示します。転送ブートストラップ期待値 (TBE) 値がノードに表示されます。

a、ヌクレアーゼおよび標的プラスミド、またはヌクレアーゼプラスミドのみの抗生物質選択の下でテストされた異なるガイド：標的ペア。 b、ヌクレアーゼおよび標的プラスミドの抗生物質選択下で試験されたCas12a2オルソログによるプラスミド形質転換の減少。 c、プラスミド形質転換における、SuCas12a2およびCas12aヌクレアーゼに関連するダイレクトリピートの交換の影響。示されたヌクレアーゼ、リピートをコードする crRNA、およびターゲットを、大腸菌での従来型 (左) および改良型 (右) のプラスミド干渉アッセイに供しました。ｄ、ｅに示すプラスミドクリアランスアッセイで使用される標的プラスミドおよび非標的プラスミドの図。 e、SuCas12s2およびLbCas12aによるプラスミドクリアランスに対する標的部位の上流のプロモーターおよびターミネーターの影響。 f、gに示すCas12a2側副サイレンシングに対する標的発現の影響を評価するために使用した無細胞TXTL反応の図。 g、標的発現部位の上流にプロモーターを有するか、プロモーターを有さないか、またはターミネーターを有するかに応じた、TXTLにおけるSuCas12a2による側副サイレンシングの効果。散布図は、4 回の技術的反復の平均値 ± SD を表します。特に明記しない限り、値は、別々のコロニーから開始した少なくとも 3 回の独立した実験の平均値 ± SD です。 ns: p > 0.05、*: p < 0.05、**: p < 0.005 片側ウェルチ t 検定で計算。

a、SuCas12a2 直接反復の予測二次構造の図。 SuCas12a2 および Cas12a の切断部位が示されています。 b、SuCas12a2を発現する大腸菌BL21(AI)のcrRNA遺伝子座にマッピングされたcDNAの配列範囲。 10 nt を超える品質フィルタリングされたすべてのリードと、プラス鎖にマッピングされた 10 ～ 55 nt のリードのカバレッジが表示されます。 c、crRNAプロセシングを破壊すると予測されるapo-SuCas12a2または2つの変異体の存在下で60分間インキュベートした56nt pre-crRNAのインビトロプロセシング。 d、3つのダイレクトリピートと3つのスペーサーを含むpre-crRNAのインビトロSuCas12a2媒介切断（3×crRNA）。 apo-SuCas12a2 を含む反応が示されています。切断反応物とapo-SuCas12a2を混合した後の時点が示されている。切断後の pre-crRNA と crRNA の推定サイズを左側に示します。最後の 2 つのレーンには、CRISPR アレイと共発現された SuCas12a2 から抽出された RNA が含まれています。インビトロアッセイにおける主要な crRNA バンド (約 67 nt) と大腸菌発現 crRNA に結合した SuCas12a2 から抽出された crRNA (約 42) のサイズの違いは、細胞内の 3' エキソヌクレアーゼによるさらなるトリミングに起因する可能性があります。。ゲルソースデータについては、補足図1を参照してください。

a、標的ssDNA、dsDNA、およびRNAの存在下での、FAM標識非標的ssDNA、dsDNA、およびRNAに対するSuCas12a2、LbCas12a、LwaCas13a、およびAbCas12gの非特異的付随活性。特に明記しない限り、すべての切断反応は 37 °C で実施されました。 AbCas12g は RNA および ssDNA によってトリガーされ、ssDNA よりも RNA の優先的な側副切断を示しましたが、dsDNA の識別可能な切断は示されませんでした。 b、FAM標識RNA（上）、ssDNA（中央）、およびdsDNA（下）非標的基質の経時的なSuCas12a2媒介切断。これらの基質は、SuCas12a2 の非特異的な副次的活性によって切断されます。 c、電気移動度シフトアッセイは、SuCas12a2およびLbCas13aがほとんど無差別にdsRNAを分解しないことを示しています。切断されていない基質と切断された生成物が示されています。 d、SuCas12a2の予測ジンクフィンガードメイン内の保存されたシステインの変異がRNA誘発性側副活動に及ぼす影響。 SuCas12a2 内の変異システインは、C1170S、C1173S、C1188S、および C1191S です。 e、SuCas12a2:crRNAおよび異なるRNA配列を含むスーパーコイルpUC19プラスミドの経時的電気移動度シフトアッセイ。 RNA 配列には、非自己標的 (3' GAAAG PFS を持つ gRNA に相補的)、標的相補体 (非自己標的の相補体)、非標的 (トランス切断アッセイで使用される RNA 配列)、PFS なし (RNA のみが使用される) が含まれます。 gRNA に対する相補性 (3' PFS なし)、自己 PFS (3' AUCUA PFS を持つ gRNA に相補的) を含みます。 RNA 配列は補足表 1 にあります。非自己標的を持つ SuCas12a2(E1063A) はネガティブコントロールとして含まれています。 NN: ヌクレアーゼなしのコントロール。ゲルソースデータについては、補足図1を参照してください。

a、ターゲットおよびコントロール大腸菌培養物からの PFS ライブラリーの配列決定範囲。 2 つの生物学的複製からのデータが示されています。 b. 2 つの複製ライブラリから得られた枯渇スコア間の相関。 c、SuCas12a2によって認識される複雑なPFSプロファイル。参考文献を参照してください。 PAM ホイールの解釈の詳細については、65 を参照してください。 PFS プロファイルの複雑さを考慮して、-1 PFS 位置の各ヌクレオチドに基づいて 4 つの異なる PAM ホイールが示されています。 d、プラスミドクリアランスアッセイを使用した、SuCas12a2を用いたPFSスクリーニングで同定された選択されたPFS配列の検証。値は、別々のコロニーから開始された 3 回以上の独立した実験の平均値 ± SD です。 ns: p > 0.05、*: p < 0.05、**: p < 0.005 片側ウェルチ t 検定で計算。

a、プラスミドクリアランスに対するガイド長の影響。ガイドシーケンスは青色の文字で示されています。 crRNAプロセシングに基づく標準的なcrRNAガイド長（拡張データ図3）は24ntです。 b、共有PAM/PFS、Cas12a2特異的PFS、および標的プラスミドおよびヌクレアーゼプラスミドまたはヌクレアーゼプラスミドのみの選択下での標的に対するミスマッチの存在下での、SuCas12a2およびLbCas12aによるプラスミド形質転換の減少。値は、別々のコロニーから開始した少なくとも 3 回の独立した実験の平均値 ± SD です。 ns: p > 0.05、*: p < 0.05、**: p < 0.005 片側ウェルチ t 検定で計算。

a、標的 (T) および非標的 (NT) 条件下で SuCas12a2、LbCas12a、および LsCas13a を発現する大腸菌 BL21(AI) から抽出された全 RNA を分離した 1% アガロースゲル。ヌクレアーゼおよび crRNA の発現は、10 nM IPTG および 0.2% アラビノースを用いて 2 時間誘導されました。各条件の個々のウェルは生物学的複製を表します。ヌクレオチドのサイズは、解決された RNA ラダーに基づいています。 sRNA プール: tRNA および他の小さな RNA を含む RNA プール。 b. 4 つの独立した実験反復にわたるバンド強度の定量化は、別々のコロニーから開始されました。有意性は、両側ウェルチ t 検定を使用して計算されました (ns: p > 0.05、*: p < 0.05、**: p < 0.005)。

接種およびヌクレアーゼおよびcrRNAの誘導の4時間後に培養物を収集した。分析の前に、細胞を DAPI で染色しました。 DAPI が低く、前方散乱が高い部分集団は、DNA 含有量が減少した細長い細胞を反映しています。等高線図は 4 つの独立した実験を表しています。

標的発現プラスミドを含み、誘導後 2 時間および 4 時間で SuCas12a2 および標的 crRNA を発現する細菌では、広範なフィラメント形成が観察できます。各重ね合わせ画像内では、蛍光 DNA (DAPI) 染色が青色で示され、膜 (FM4-64) 染色が赤色で示されています。ペアの画像は 2 つの独立した実験を表しています。

a、37℃でのSuCas12a2によるRNAビーコンの標的RNA活性化切断の進行曲線。 b. 速度法を使用して決定された、RNA ビーコンを使用した SuCas12a2 の検出限界 46。速度は、進行曲線の線形領域の回帰分析によって得られました。報告されているすべての検出限界を決定するために、速度法が使用されました。 c、周囲温度（RT）でのCas12a2によるssDNAビーコンの標的RNA活性化切断の進行曲線。 a と c のエラーバーは、3 つの独立した測定値の平均と標準偏差を表します。 b のエラーバーは、3 つの独立した測定値の線形近似の標準誤差を表します。 d、プラスミドニッキングおよびニックトランスレーションに基づく検出アッセイの概要。 e, ca33Cas12a2-gRNA RNP (100 nM) および示された RNA (1 nM) とともにインキュベートされた分解されたプラスミド基質。ニックトランスレーションを開始する前のインキュベーション時間が各実験条件について示されています。最初のレーン (プラスミドのみ) は、RNP なしでインキュベートされたプラスミドを表します。非ターゲット RNA1: COA1 gRNA および SARS-CoV-2 RNA。非ターゲット RNA2: SARS-CoV-2 gRNA および COA1 RNA。 f、eとは異なる反応によるニックトランスレーション後の蛍光測定。蛍光値は、プラスミドのみの対照の蛍光値に対して正規化しました。陽性対照として、プラスミドを DNase I と DNA ポリメラーゼ I の混合に供しました。値は 3 回の独立した実験の平均値 ± SD です。有意性は、値 1 と比較した両側ウェルチ t 検定を使用して計算されました (ns: p > 0.05、*: p < 0.05、**: p < 0.005)。ゲルソースデータについては、補足図1を参照してください。

ゲルソースデータ。

補足図。 2〜9と補足図1の凡例。

補足表 1 ～ 5。

Cas12a2、Cas12a、および Cas12b のアミノ酸配列をリストした Fasta ファイル。

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転載と許可

Dmytrenko, O.、Neumann, GC、Hallmark, T. 他 Cas12a2 は、RNA によって引き起こされる dsDNA の破壊を通じて不育症感染を引き起こします。 Nature 613、588–594 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05559-3

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受信日: 2022 年 6 月 13 日

受理日: 2022 年 11 月 11 日

公開日: 2023 年 1 月 4 日

発行日: 2023 年 1 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05559-3

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自然 (2023)

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